CART细胞不同表型的影响因素及其分析

刘军连讲hpv http://www.cgia.cn/news/chuangyi/1585967.html

CAR-T细胞疗法是一种针对癌症患者的新型治疗方式，尤其是对于血液系统恶性肿瘤[1-4]。最近的研究表明，治疗功效与T细胞亚群（CD4+或CD8+）的比例，分化（幼稚，记忆，效应子），激活（激活标记的表达）和CAR-T细胞的功能状态有关。产生并注入患者体内[5-8]。

已经证明CD4+和CD8+CAR-T细胞能够杀死肿瘤细胞，但是CD4+CAR-T细胞的活性比CD8+CAR-T细胞慢[5]。然而，其他研究表明，在肿瘤治疗中，CD4+和CD8+CAR-T细胞之间具有协同作用，因为用两种细胞治疗的动物均能延长生存期[6]。可能影响CAR-T细胞活性以及体内持久性的另一个重要方面是CAR-T细胞产物的组成（比例CD4+和CD8+T细胞亚群）[6]。非霍奇金淋巴瘤患者的幼稚和中枢记忆CD4+CAR-T细胞转移到动物模型后，其抗肿瘤活性高于效应记忆CD4+CAR-T细胞。此外，这些患者的中枢记忆CD8+CAR-T细胞也比幼稚和效应记忆CD8+CAR-T细胞具有更高的抗肿瘤活性[6]。当CAR-T细胞在循环中长期存在时，用CAR-T细胞治疗的神经母细胞瘤患者表现出更好的临床反应，这与高比例的CD4+T细胞和中枢记忆（CD4+和CD8+T细胞）有关在最终的细胞产物中[7]。此外，接受中央记忆CD4+和CD8+CAR-T细胞治疗的B细胞非霍奇金淋巴瘤患者中有75％在治疗后1年没有疾病进展[8]。

除了T细胞亚型，CART细胞的分化状态对于治疗成功也起着至关重要的作用。分离的和离体扩增的T细胞具有细胞免疫疗法必须考虑的固有特性。T细胞的功能，表型特征及其在健康供体和患者外周血（PB）中的外观各不相同，具体取决于年龄，先前的抗原暴露以及由于其分化状态而应用的细胞毒性疗法[5]。在ACT中，末端分化的CD45RA+CCR7T效应细胞（Teff细胞）表现出增强的体外抗肿瘤活性，而体内T细胞的活化，增殖能力和持久性受损[14]。这些发现改变了为ACT选择特定T细胞亚群的方法和标准，并将重点放在分化程度较低的T细胞上：定义为CD45RA+CD45ROCD95ROCD95T细胞的幼稚样T细胞（TN细胞）表达了淋巴结归巢标记CCR7和CD6L，以及CD8和CD7[17]。相反，CD45RACD45RO+CD95+记忆T细胞可分为CD6L+CCR7+T中央记忆样细胞（TCM细胞）和CD6LCCR7T区段记忆样细胞（TEM细胞）[17]。干细胞记忆样T细胞（TSCM细胞）代表了最近描述的T细胞亚群，类似于TN细胞，因为它们是CD45RA+CD45ROCCR7+，并且它们表达与记忆相关的标志物，例如CD95，从而表现出干细胞的特性，包括高增生和自我更新能力[5,6]。

干细胞样T细胞（TSCM）是记忆淋巴细胞的一个子集，表达表达CD45RA，CD6L，CD95，CCR7，CD7，CD8，CD17，CD11adim和缺乏CD45RO的标志物，这些标志物具有自我更新和分化的能力在记忆和效应T细胞中[9，10]。基于它们的特性，TSCM细胞对于过继转移细胞疗法非常有趣[11]。确实，CAR-TSCM在输注后可以在人类中生存十多年，并保持其功能活动[1]。

向患者给药后，TN细胞和TSCM细胞具有在体内长期生存和增殖的能力，它们可能导致临床结果的改善[16,6,7]。特别是，自我更新的能力以及在所有记忆和效应亚群中分化的能力使TSCM细胞通过为免疫攻击提供更多分化的TEM细胞和TE细胞，从而维持长期的抗肿瘤活性。用分化程度较低的新TSCM细胞和TCM细胞刷新T细胞库[17]。因此，大量减少分化的CART细胞的输血对于治疗成功是有利的。单个T细胞亚群的潜力在文献中有很好的描述[17]。但是，关于在生产过程中如何在最终的CART细胞产品中形成更有利的细胞组成和T细胞表型的描述很少。

一、影响细胞表型的影响因素

这些临床反应的基础严重依赖于细胞产品的质量，在离体细胞制造过程中，细胞产品的质量可能会受到多种因素的影响。这些包括起始材料，T细胞活化的方式，基因修饰和培养条件。此外，多项研究证明了具有过继记忆的早期记忆分化（天然-TN[1]，中央记忆-TCM[]或干细胞记忆-TSCM[3]）表型的T细胞的功能优势。

1、原材料（此处指从患者身上得到的PBMC）所生产的T细胞输出的表型受原始细胞材料质量的影响很大。与健康供体相比，未经治疗的CLL患者生产的CAR-T细胞产生的TNCD4和CD8T细胞更少，并且在生产结束时表现出更多的衰竭表型，包括更高百分比的PD-1+细胞[4]。患者的年龄也影响T细胞产物的增殖和细胞毒性。比较来自年轻和老龄有免疫能力的小鼠的鼠抗CD19CAR-T细胞的表型特征，表明年轻小鼠（6-1周龄）的T细胞产生更多的TN和TCM表型，而老年小鼠（7周龄）的T细胞产生更多的产生效应子记忆（TEM）和效应子（TE）表型[5]。为了优化原材料，以期获得更有效的制造细胞产品，可以采用几个选择步骤。一种选择是分离CD8+TCM细胞。为此，可通过阴性选择去除外周血单核细胞（PBMC）的CD14+，CD45RA+和CD4+，然后阳性选择CD6L表达[7]。、T细胞活化

共刺激对于TN细胞增殖，细胞因子分泌和持久性至关重要。已经考虑到CD8在定量和定性上均对驱动T细胞活化的信号通路产生了贡献（参见参考文献[17]）。其他共刺激分子，例如ICOS，CD，OX40和4-1BB，在与它们各自的配体（ICOSL，LFA-3/CD58，OX40L和4-1BBL）结合后会提供正的共刺激信号影响T细胞分化，效应器功能和精疲力竭。例如，通过ICOS共同刺激可促进CD4T细胞分化为Th17表型，并增加白介素1（IL-1），IL-17和干扰素-γ（IFN-γ）的分泌[18]。通过CD共同刺激与CD8共同刺激相结合，可恢复IL7R表达并减少T细胞衰竭[19]。

用于pMHC和共刺激配体。由于CD3ε亚基和共刺激受体是单态蛋白，因此这些工具可实现MHC依赖性的T细胞活化和扩增。从而确保制造平台具有广泛的适用性。激动性抗CD8抗体替代大剂量（?U/mL）IL-也已用于离体激活T细胞。通常通过用可溶性抗体，抗体包被的聚合物纳米基质（TransACT，MiltenyiBiotech）或抗体包被的磁珠（例如DynabeadsHumanT-扩增子CD3/CD8（ThermoFisher）的比率为1:10至10：1的珠子与T细胞。使用磁珠的离体扩增优化表明，低的珠子与T细胞比率（?1：10-1：5）减少了活化诱导的细胞死亡，并保留了病毒特异性记忆T细胞的功能[0]。

3、基因修饰

转基因本身可以在整个制造过程中产生不同的影响。例如，一些CAR分子具有良好的特征，表现出强直性信号传导，该信号传导由T细胞表面CAR分子的非均一聚集驱动的非抗原依赖性和自主信号传导组成。比较含有CD8共刺激结构域的抗CD19和抗GDCAR分子的体外扩增时，一组研究人员发现抗GDCAR-T细胞的扩增减少，精疲力竭分子表达增加，凋亡率更高。由于两个CAR-T细胞都具有相似的激活水平，所以制造的产品表型的差异可以归因于CAR转基因[5]。用CD8共刺激结构域替代4-1BB共刺激结构域可减少CAR-T细胞衰竭表型并改善抗肿瘤功能。

相比之下，另一组研究表明具有4-1BB共刺激结构域的抗CD19和抗GDCAR-T细胞表现出了限制体外T细胞扩增的tonic信号传导，当病毒载体从非自我灭活的γ逆转录病毒载体变为自我灭活的慢病毒载体[6]。

CAR信号传导还可影响CAR-T细胞的代谢特性和记忆特征。例如，具有4-1BB共刺激结构域的抗CD19CAR-T细胞表现出增加的脂肪酸氧化，增强的线粒体生物发生和中央记忆表型，而CD8共同刺激的CAR-T细胞产生效应记忆细胞。具有糖酵解代谢特征[8]。

细胞工程师还将其他转基因整合到CAR-T细胞生产中，以影响T细胞的扩增和分化。经过工程设计以表达FasDNR的T细胞在过继转移后表现出优异的总体扩增，持久性和抗肿瘤功效，而不会引起不受控制的T细胞淋巴增生或脱靶自身免疫。这些发现证明了潜在的基因修饰策略可增强用于广泛范围治疗人类恶性肿瘤的离体制造的T细胞疗法的扩展和存活率。

4、培养补充剂

用外源细胞因子或小分子抑制剂补充T细胞扩增培养基也会影响CAR-T细胞的表型和扩增。最初，CAR-T细胞生产使用补充性IL-，因为它对T细胞具有有效的刺激和增殖作用。但是，考虑到长时间暴露于IL-会促进T细胞的终末分化[33]，补充IL-对于过继T细胞转移和体内T细胞持久性可能不是理想的选择。

激活后降低IL-的浓度和暴露时间会产生较少的分化记忆T细胞，而较高的IL-则通过降低TCM来减少早期记忆T细胞的生成[35]。同样，在IL-中培养更短时间的CAR-T已显示出可在体外和体内更有效地控制肿瘤的同时增加记忆性CAR-T细胞[36]。

IL-7/IL15组合产生了优异的抗原特异性细胞溶解活性以及高水平的Th1细胞因子分泌。

CAR-T细胞依赖于多种因素来生产高质量和临床有效的最终产品。这些因素包括原料的组成和优化，T细胞活化的方式，基因修饰的方法以及转基因整合的影响以及外源性补充。

二、不同细胞表型的检测方法：

在这种情况下，CAR-T细胞的免疫表型表征对于建立成功的CAR-T细胞疗法至关重要。作者介绍了一个流式细胞仪检测方法，用于在生物过程的每个步骤中表征幼稚，记忆和效应CAR-T细胞亚群。

具体的步骤是：

1、CAR-T细胞中CAR的染色

、T细胞免疫分型

~~~详细试剂信息详见书籍《ChimericAntigenReceptorTCells:DevelopmentandProduction》第14章和15章，部分内容来自文献doi：10./ijms。

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