B细胞恶性肿瘤中Ibrutinib耐药性

引言：本次为大家介绍一篇发表于TrendsinCancer上的文章，作者BijalShah来自美国佛罗里达州坦帕市H.LeeMoffitt癌症中心和研究所，题目为ResistancetoIbrutinibinBCellMalignancies:OneSizeDoesNotFitAll

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Introduction

B细胞淋巴瘤中Ibrutinib耐药(IR)的复杂性

Ibrutinib，一种布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，在多种B细胞淋巴瘤中具有显著的活性。然而，B细胞淋巴瘤的复发现象也是非常普遍，并与不良的结果相关。IR涉及细胞内关键信号通路的突变、重编程和重新激活，从而可以避开靶向激酶信号通路。抑制BTK导致从激酶组重构和基因表达变化演变而来的适应性信号通路的复杂重组。这些事件部分是由来自TME的外部信号调控。恶性细胞与TME之间的相互作用决定了临床行为，预后和对治疗的反应，从而促进了疾病的复发。在TME中，趋化因子和整合素介导的恶性细胞向非恶性间质细胞的迁移和粘附保护了药物诱导的细胞凋亡和耐药性。

BTK抑制剂具有分子效应，而BTK在淋巴瘤生物学中的关键作用尚无法解释。特别是，ibrutinib可在慢性淋巴细胞白血病(CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)患者中迅速诱导淋巴细胞增多(循环淋巴细胞数量增加)，同时伴有淋巴结消退，这表明ibrutinib损害了淋巴结、骨髓和其他部位的B细胞的归巢和滞留。针对B细胞受体(BCR)信号通路的Syk和磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂也观察到了类似的现象。事实上，这些抑制剂的最初成功归因于BCR依赖性淋巴瘤-TME相互作用的减弱，包括它们对BCR和趋化因子控制的整合素介导的恶性B细胞粘附和归巢的影响，以支持淋巴结和骨髓TME的生长和存活。显然，TME对淋巴瘤的生存、进展和IR的发展是不可或缺的。了解TME介导（新生）和获得性耐药的广度，以及它们的统一信号网络和机制联系，对于制定持久临床疗效的适当治疗策略至关重要。

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Results

激酶组网络重塑驱动IR

许多肿瘤对激酶抑制剂的反应是信号网络的快速适应性改变，从而避开靶向癌蛋白。可以测量数百种激酶的多重抑制剂微珠定量质谱技术已显示，肿瘤细胞通过自适应激酶网络重编程获得对靶向治疗的耐药性。具体来说，正是这种适应性的重新编程导致了治疗的最终失败。然而，迄今为止还不清楚激酶介导的耐药机制是否参与IR。

为了了解IR的复杂性，作者通过产生耐药的MCL细胞系建立获得性耐药模型，并利用化学蛋白质组学来确定与其发展相关的关键激酶信号通路。基于蛋白质图谱用于鉴定亲本细胞和IR细胞之间的整体激酶组适应性。当在系统水平上比较细胞间的相对激酶活性时，发现IR细胞的激酶组显著改变，其中许多激酶活性增加。IR细胞在生存/生长过程中显著富集激酶，包括周期蛋白依赖激酶、整合素连接激酶、DNA损伤反应蛋白和JAK-STAT(Janus激酶-信号转导因子和转录激活因子)。当比较ibrutinib治疗后的激酶组变化时，作者发现在敏感细胞中激酶/通路活性受到抑制，而在IR细胞中激酶/通路活性保持不变或升高。正如预期的那样，IR细胞对ibrutinib的反应比亲本细胞更迟钝，在ibrutinib的作用下，许多激酶的活性没有变化甚至增加，这支持了BTK独立激酶或BTK旁路通路驱动IR的概念。有趣的是，这种适应性反应伴随着ibrutinib治疗后IR细胞的细胞-细胞粘附、增殖和对化疗的耐药性增加，进一步突出了这些全局变化如何影响激酶组。因此，对于特定的治疗，获得性IR不是单一的机制，当MCL细胞对靶向治疗产生耐药性时，许多信号网络进行重塑。

TME对IR的影响

传统上，研究获得性耐药的方法是将癌细胞长期暴露于不断增加的药物剂量中。这些体外模型有助于确定调节药物反应的机制，在某些情况下，还有助于识别药物靶点。然而，这些模型都不能解释耐药表型出现的TME。使用原始的IR细胞系对，作者解决了TME的细胞成分如何影响获得性耐药性的问题，也进一步确定了(i)新生(TME介导)耐药细胞的激酶组网络;（ii）获得性耐药（长期暴露）细胞的激酶组网络；（iii）粘附在基质上的IR细胞的激酶组网络。通过对IR相关激酶组的进一步定位，发现PI3K-AKT-mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶标)通路是IRMCL细胞中的中心信号传导枢纽。功能研究表明，PI3K-AKT-mTOR的激活有助于β1整合素的表达增加，导致IRMCL细胞的持续细胞粘附和基质介导的存活。最近的研究也证明了持续的AKT-mTOR通路激活对IR发展的作用。

在长期暴露于ibrutinib后，MCL细胞的特征是AKT-mTOR通路和其他信号通路的强制激活，PI3K-AKT-mTOR信号通路被确定为外部B细胞微环境和内部信号通路之间的中心枢纽。在ibrutinib存在的情况下，IRMCL细胞中PI3K-AKT-mTOR通路的激活导致β1整合素表达增加,并且与原始细胞相比IR细胞粘附并与TME相互作用的可能性更大。在ibrutinib存在的下,药物原始细胞从基质中释放，而IR细胞在TME中被选择、保留和富集，这表明TME介导的和获得性耐药机制与复发的侵袭性具有协同作用（图1）。重要的是，对ibrutinib具有选择性耐药的MCL中的激酶组重编程有助于以一种不同的方式促进TME信号的接收，促进更具攻击性的表型。因此，IR的演变及其临床后遗症是通过肿瘤与其微环境之间的动态和双向的相互作用产生的。

克服IR的潜在治疗策略

在设计合理的组合来克服IR时，有必要了解和整合肿瘤细胞适应的多种机制，并了解可能发生在治疗之前、治疗期间以及治疗之后驱动克隆演化的耐药机制。淋巴瘤细胞是一个异质性的细胞状态集合，具有不同的信号转导网络，可促进IR-MCL肿瘤的生长和存活。因此，这些不同的IR机制对治疗带来了重大挑战。用组合方法靶向旁路机制或抑制激酶组重编程或其常见的上游驱动因素可能是克服耐药性和改善目前B细胞恶性肿瘤治疗的更有效的方法。

用组合方法靶向旁路机制

靶向旁路机制的一个主要挑战是确定促进IR的主要激酶通路。MCL细胞中，在治疗期间随着耐药性的出现，信号通路网络以多种方式重塑(图2)。在之前的研究中，PI3K-AKT-mTOR通路被确定为IRMCL细胞的中心信号枢纽，作者发现下游靶标有助于增加β1整合素的表达，增强细胞粘附到TME基质细胞，并促进克隆生长。这为PI3K-AKT-mTOR抑制剂联合ibrutinib克服耐药性提供了强有力的证据。在临床前期研究中，PI3Kpg/d抑制剂与ibrutinib联合应用在MCL、CLL和其他B细胞淋巴瘤的IR中显示活性。针对BTK下游BCRs的研究，如蛋白激酶(PKC)和磷脂酶Cγ，也显示了CLL和MCL的临床前疗效。

最近，BCL-2家族蛋白已成为许多B细胞淋巴瘤的关键治疗靶点。Venetoclax(ABT-)是一类首个对BCL-2具有亚纳摩尔亲和力的选择性口服抑制剂，在体外对非霍奇金淋巴瘤、CLL和急性白血病具有抗肿瘤活性。在小鼠体内进行异种移植研究中，它也显示出抗侵袭性淋巴瘤的活性。因此，venetoclax已成为治疗许多侵袭性B细胞淋巴瘤亚型的令人满意的药物，并可能在IR发展后发挥重要作用。事实上，诸多数据表明，IRMCL细胞的重编程更依赖于BCL-2，而BTK抑制增强了线粒体对BCL-2的依赖性。这可能归因于PI3K-mTOR通路的持续激活，导致髓系白血病细胞分化蛋白（MCL）-1磷酸化和降解，最终导致IR-MCL细胞中BCL-2与MCL-1的高比率。事实上，venetoclax和ibrutinib在体内和体外协同抑制对ibrutinib敏感和耐药的CLL细胞的生长。总体而言，这些数据表明靶向补偿性PI3K-AKT-mTOR、PKCβ和BCL-2通路可能成为克服IR的新型联合治疗策略。然而，值得注意的是，在特定的患者中，可能会选择这些通路之外的其他潜在信号通路。进一步强调了需要继续研究，开发个体化治疗途径。

靶向转录机制以消除IR相关的激酶组重塑

在MCL中，IR的一个重要机制是适应性激酶网络重塑和恢复，它可以克服最初的药物损伤（图2B）。作者认为，关键转录调节因子的失调不仅决定了癌症的表型，而且对耐药性的发展至关重要。最近的研究表明，自适应基因组重编程和癌细胞状态的改变是由不同的超增强子位点上的表观遗传调控因子（[例如，含溴结构域的蛋白质（BRD）4，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）7，CDK9和RNA聚合酶II（RNAP2）]）协调的基因表达程序引起的（图2B）。总体而言，适应性反应涉及多种激酶的转录上调，这表明细胞增殖和耐药性增强，并且增强了TME-MCL细胞相互作用以及TME介导的IRMCL细胞耐药。来自激酶组和转录组的适应性反应可重新激活靶标通路或启动旁路，最终限制靶向治疗的持久性。为此，抑制促进激酶重塑的常见转录机制可能是另一种更有效的克服耐药性的策略。

最近，Zawistowski等人证明了在三阴性乳腺癌患者中使用曲美替尼抑制MEK1/2可引起显著的转录反应，包括整体受体酪氨酸激酶的上调。更具体地说，MEK抑制诱导全基因组增强子的形成，包括BRD4、H3K27乙酰化和p增强子的形成，以促进转录适应。对P-TEFb相关蛋白BRD4和CDK9的抑制阻止了激酶组的上调，克服了曲美替尼的耐药性，并在体内外产生了持续的生长抑制。这些非基因组适应性旁路机制，例如，涉及受体酪氨酸激酶的转录上调，并不局限于乳腺癌。相反，它们被越来越多地认为是许多其他癌症临床耐药性的主要机制。因此，靶向参与转录程序的蛋白质，如BRD4，可作为一种新的治疗干预手段。最近有报道称，用JQ1靶向布罗莫结构域和外末端结构域（BET）蛋白布罗莫结构域可降低MYC、CDK4/6、RelA和BCL2蛋白水平以及IRMCL中核因子（NF）-kB靶基因的表达，表明布罗莫结构域抑制剂对IRMCL具有很高的活性。从机制上讲，BET蛋白在增强子处组装了一个核心调节蛋白复合物，从而调控基因转录。最近的研究表明MYC过表达可以促进对BCR信号通路的药理抑制剂(如ibrutinib)的耐药性，进一步证明了这些发现的重要性。

热休克蛋白(Hsp)90抑制剂也被证明可通过调节多种致癌途径，包括NF-kB信号通路来克服MCL中的IR。这可能是由于Hsp90可对序列特异性转录因子、染色质可及性和RNAP2活性的进行调节。因此，Hsp90的失调也可能通过调节转录机制来影响IR过程，从而成为IRMCL的创新靶点。因此，靶向转录机制可能是阻止激酶组重塑和IR形成的有效策略，可为MCL和许多其他类型的癌症提供另一种治疗选择。

在原始样本上实施基于细胞的药物筛选作为针对IR患者个体化治疗的临床工具

尽管分子靶向治疗持续改善癌症患者的预后，但肿瘤间和肿瘤内异质性和肿瘤可塑性限制了其疗效和持久性。细胞系的使用虽然在癌症生物学中很重要，但鉴于在人工培养条件下生长所需的基因型/表型变化，可能不是转化应用的最佳选择。因此，有必要在体外药敏和耐药试验的基础上，有一个全面的功能策略来直接确定癌细胞的药物依赖性。这样的策略可在最相关的模型系统（患者样本）中进行药物反应的动力学研究。这将促进更个性化的方法和更具临床相关性的系统来预测和解决癌症患者的耐药性。为此，作者利用最新开发的基于细胞的药物筛选分析来优化和定制治疗策略(图2C)。为此，作者使用一种新的体外微流控细胞平台EMMA（exvivoMathematicalmalucityAdvisor）在敏感性和IR-MCL细胞系以及原发性MCL和骨髓瘤样本中评估三维重建TME中的药物反应。无论离体试验与体内条件有多接近，基于体外试验预测患者的临床反应是一项重大挑战。最大的困难是将持续数天的检测结果转化为数月甚至数年的临床反应评估。

作者通过使用数学模型解释了肿瘤异质性、药效动力学和用受试表型（药物敏感性）估算的药代动力学。众所周知，自然选择的是表型，而不是基因型，并且多种基因型可以产生相同的表型。这种非排他性的关系使得单从基因型甚至基因表达谱来预测临床结果具有挑战性。无论基因型背景如何，EMMA直接识别亚群的表型（或功能）表现，从而消除了“middleman”并产生了计算机模拟的临床反应输出。通过对体外化疗敏感性结果的非线性回归，该模型生成的临床反应轨迹在预测结果方面具有高度的准确性。使用这种一流的自动化，计算机模拟，预测性药物反应分析方法，在骨髓TME的离体重建（包括患者来源的细胞外基质和患者来源的可溶性因子）中，针对一组药物从活检组织中筛选了原发性骨髓瘤/淋巴瘤细胞。然后将亲代（敏感）或IR-MCL细胞接种于孔板中，该孔板先前包被有人源性基质细胞和胶原-1，随后使用一组试剂和IR模型进行药物筛选。AKT和mTOR抑制剂(MK和INK)在IR细胞中表现出比原始MCL细胞更显著的细胞活力衰减。此外，筛选结果通过MCL患者来源的异种移植模型进行了独立验证。因此，基于细胞的药物筛选可以指导MCL克服IR的靶向治疗方案的选择。当该药物筛选试验也应用于多发性骨髓瘤患者时，根据国际骨髓瘤工作组反应水平分层，该试验正确地将96%划分为应答者/无应答者，预测和实际肿瘤负荷测量之间存在显著相关性。这种基于细胞的药物筛选试验证明了其用于评价药物临床疗效方面的可行性。

该平台的准确性、重现性、短周期（5天）和高通量潜力表明，这种基于细胞的药物筛选在TME环境下是一种很有前途的针对MCL和其他B细胞淋巴瘤的有效个体化治疗工具。通过这种个性化的方法，我们将能够在适当的时间为适当的患者提供适当的药物。重要的是，药物筛选结果与化学蛋白质组学实验结果密切相关，表明这种药物筛选分析是一个创新的平台，有助于进一步探索IR机制，设计有效的个体化联合治疗方案，以克服IR。

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Conclusions

当给予治疗压力时，淋巴瘤和间质细胞都会发生一系列的细胞反应，产生一个正反馈回路，放大促生存和生长信号，最终获得IR表型。包括IR在内的耐药性发生很少依赖于单一的异常途径;当淋巴瘤细胞对靶向治疗产生耐药性时，信号通路网络会以无数种方式重塑。因此，鉴定与耐药性进化相关的激酶组和转录组常见的信号通路节点或驱动因素是必要的。由于肿瘤进化的动态性和复杂性，以及突变与治疗反应之间往往缺乏相关性，因此基于细胞的药物筛选平台结合高通量的个性化动力学模型可以解决这些复杂的问题，可能允许针对个别患者定制精确的治疗组合方案。今后，将这种方法与基因组、功能转录组和蛋白质组相结合应用于原发性和复发性肿瘤，将确定驱动肿瘤进展和治疗耐药性的新机制，从而有助于在适当的时间在合适的患者中确定最佳的组合治疗策略。抑制这些通路和耐药网络可以更有效地克服耐药性，并改善MCL和其他B细胞恶性肿瘤的当前的治疗方案。

参考文献

ShahB,ZhaoX,SilvaAS,ShainKH,TaoJ.ResistancetoIbrutinibinBCellMalignancies:OneSizeDoesNotFitAll.TrendsCancer.;4(3):-.

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