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实验小站原代培养系列十四外周血淋巴
实验小站：原代培养系列（十四）
外周血淋巴细胞分离培养
1实验来源
人外周血
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主要试剂
(1)培养基
(2)胎牛血清（FBS）
(3)HumanGM-CSF
(4)HumanIL-4
(5)HumanTNF-a
(6)PBS
(7)青霉素-链霉素溶液（X）
(8)DMSO
(9)台盼蓝粉末
(10)人外周血淋巴细胞分离液
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主要试剂配制
（1）PBS：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至0mL，调pH7.2，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）RPIM-培养基：临用前根据需要加15%胎牛血清，最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为U/mL和U/mL，置于4℃冰箱保存。
（3）台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至mL，rpm离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。
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实验步骤
一、PBMC原代分离步骤
1)抽取人的外周血于肝素抗凝管中，取足5mL新鲜血液，加入PBS按1：1稀释血液（一般采血管2mL+2mL）。
2)取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用。
3)吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面。
4)室温，离心rpm，20min。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。
5)小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞。加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心rpm，10min。
6)去上清液，加入培养基1mL混匀，取少量进行细胞计数。
7)用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性：取2滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，5-10min后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。计数个细胞，计算活细胞百分率，活性应在95％以上。
二、DC细胞诱导
1)将收集的PBMC在培养基，在37℃、5%CO2条件下在培养板培养4h。
2)轻轻吸取上清，收集贴壁细胞，加入含15%血清，ng/mlrhGM-CSF、ng/mlrhIL-4的培养基，培养5～7d获得未成熟DC，用25ng/mlhTNF-α刺激2～3天，获得成熟DC。
3)用倒置显微镜观察细胞形态，至细胞毛刺样突起，有典型DC形态悬浮细胞。
三、注意事项：
细胞最好在细胞贴壁注：分离后细胞最好在贴壁后当天换液（贴壁细胞贴壁能力很弱，润洗时轻柔），过夜后部分细胞漂浮，细胞得率减少。
四、常见问题解答：
1、人外周血单个核细胞分离后培养，有很多针尖大小的圆形细胞，是什么东西，如何去除？
我觉得可能是血小板其密度很低，主要在血浆中，吸膜层最好小心点，尽量不要吸到过多血浆，血浆含有血小板，影响不会很大，后面换液可去除，或者分离后细胞多洗几遍，最后用0rpm低离心去除，就可以了。
2、DC细胞最长可养多长时间？
DC是无法扩增，维持时间我养了3周也没问题，到那时候细胞还没有死，我看有人可以养更久，但养久了太费因子，最好根据实验及时处理。如果你需要长时间培养就最好节省因子（消耗太贵）可以考虑IL4用半量，3天半量离心换液补因子。
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细胞形态
48h开始发现半悬浮细胞增多，3～4d细胞开始出现不规则形状，5～7天开始出现成簇现象，细胞出现不规则毛刺，hTNF-α刺激2～3天，随着培养时间延长，成簇细胞逐渐散开，细胞表面毛刺状突起更明显。
PBMC细胞形态：
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X-2h贴壁换液后
DC细胞形态
诱导第4d
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诱导第6d
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DC诱导成熟：
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