长骨骨骺软骨管中淋巴管的形态特征

　【摘要】　目的　研究骨骺中软骨管与淋巴管的结构和分布，并探讨它们之间的关系。方法　8、14、22、29周死胎和死亡新生儿胫骨近端骨骺，用he、改良的5-核苷酸酶组化染色方法及透射电镜观察。结果　胎儿8周时无软骨管出现，14周时数目较少，22周时增多，29周时最多，分支复杂，向心性走行，呈“枯树枝”样结构，末端分支为盲端，彼此之间互不吻合。新生儿次级骨化中心已经出现，软骨管数目减少，生长板内可见交通软骨管。软骨管由软骨膜和交叉韧带附着处长入，多由微动脉、微静脉、毛细血管和疏松结缔组织组成，1/5的软骨管尚含有淋巴管。毛细淋巴管多分布于骺近中心和生长板的静止带，由单层内皮细胞构成，基底膜缺如，无周细胞，内皮重叠连接，有锚丝同外周的胶原纤维相连。结论　胎儿胫骨近端骨骺中存在淋巴管，淋巴管是软骨管的重要组成部分。

　　近年有学者报道人椎间盘软骨板和膝半月板中存在淋巴管，改变了软骨中没有淋巴系统的传统观念，并认为淋巴管具有维持组织的生物力学特性、参与软骨损伤愈合的功能^［1，2］，为软骨疾病的研究提出了新课题。然而，截止目前尚没有骨骺软骨淋巴系统的报道，本研究用组织化学方法及透射电镜探讨这一问题，同时阐明淋巴管与软骨管的关系。

　　材料与方法

　　材料

　　8周、14周、22周、29周死胎和死亡新生儿胫骨近端骨骺。萘酚as-bi、固红tr（sigma公司）。

　　方法

　　1.大体标本　矢状面切取全骺1.0mm厚切片,质量分数为10%甲醛固定，nikonmicroscope-fax显微摄像，放大4倍。

　　2.he染色　标本离体后，质量分数为10%甲醛固定7d，edta脱钙30d，常规脱水、石蜡包埋、切片，he染色，普通光镜观察。

　　3.组织化学染色　5’-核苷酸酶反应和碱性磷酸酶反应组织化学染色，冰冻切片，体积分数为4%的甲醛固定2min。溶有5mmmgso₄，2mmpb（no₃）₂135mm蔗糖和2mmamp的0.2mtrismaleate(顺丁烯二酸)缓冲液(ph7.2)，37℃浸染35min。溶有25mg萘酚as-bi，50mgfastred的0.1mtris-hcl缓冲液(ph9.2),37℃浸染60min。普通光镜观察。

　　4.透射电镜观察　标本离体后，分别于矢状面骺边缘、近中心、中心，横断面边缘、近中心、中心切取1.0mm×1.0mm×1.0mm标本，常规清洗、固定、脱水、树脂包埋，半薄切片定位，lkb超薄切片机切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色，jem-1200ex透射电镜观察。

　　结果

　　大体标本观察：胎儿胫骨近端骨骺是软骨骺，8周时尚无软骨管出现，14周时软骨管数目较少，22周时数目增多，29周时数目最多，发育最完善，呈“枯树枝”样结构（图1），除多从软骨膜长入，向心性走行外，还可见由交叉韧带附着处长入；骺外带粗大而稀疏，近中心密集而分支复杂，中心部位移行为盲端。新生儿次级骨化中心已经形成，直径约3mm，软骨管数目减少，可见一连接干骺端与关节面的交通软骨管。

图1　29周胎儿胫骨近端骨骺，可见发育完善、分支复杂的软骨管，×4

　　he染色：软骨管为疏松结缔组织包绕的管状结构，其内血管呈丛状分布。在骺软骨边缘，可见软骨膜向基质呈囊状内折凹陷，顶端存在管腔结构。软骨管内动脉壁厚，似有平滑肌，多位于软骨管的中心部位，伴行静脉腔大壁薄，毛细血管位于软骨管的周边，腔内有红细胞。软骨管终端为毛细血管球。此外，软骨管内还可见一些壁薄不规则的管腔结构，腔内无明显内容物（图2）。

图2　29周胎儿骺近中习软骨管，除动、静肪和毛细血客，

　　还包含内皮薄、开头不规则的管状结构，he染色×200

　　组织化学染色：淋巴管内皮细胞中的5’-核苷酸酶使棕色的铅化合物沉淀，血管内皮无该酶而呈现碱性磷酸酶反应阳性着色——红色，由此提示淋巴管内皮呈棕色，血管内皮呈红色。14周胎儿胫骨近端骨骺软骨管中没有淋巴管，22周、29周胎儿和新生儿有淋巴管，与软骨膜或交叉韧带内的淋巴管相连续（图3）。软骨管内淋巴管的出现率约为1/5，在次级骨化中心出现之前主要分布在骺近中心，以后主要分布在生长板的静止带和增殖带。

图3　22周胎儿骨骺生长板静止带和增殖带内的淋巴管（l），

　　与血管伴随，阴化染色×400

　　透射电镜观察：骨骺软骨管内，毛细血管直径7～9μm，内皮厚0.2～0.4μm，基底膜连接，有周细胞，内皮细胞紧密连接，胞浆内有大小均匀的质膜小泡（图4）。另外可见同毛细血管结构特征明显不同的毛细淋巴管，腔大，壁薄约0.1μm，基底膜不连续或缺如，无周细胞，内皮胞浆内有大小不同的质膜小泡（图5a），内皮细胞多以重叠连接（图5b），有时呈开放状态，间隙达60～100nm（图5c），内皮外有锚丝，直径6～8nm，延伸到周围结缔组织中（图5d）。

图4　14周胎儿骨骺中心的毛细血管，由3个内皮细胞组成，

　　紧密连续，基底膜连续，其外有周细胞。透射电镜×10k。

　　图5　29周胎儿骨骺近中心的毛细淋巴管(a,b,c,d):a　内皮薄，

　　无周细胞，无基底膜，可见吞饮泡。透射电镜×3000。

　　b　内皮细胞重叠连接。透射电镜×25k。c　细胞连接呈开放状态，

　　透射电镜×25k。d　内皮外的锚丝，部分同胶原纤维相连。透射电镜×10k。

4，5　骨骺软管透射电镜图

　　讨论

　　胎儿长骨骨骺为软骨骺，软骨内的血管以软骨管形式存在于发育时期的骨骺软骨内，多数学者认为软骨管由软骨膜长入，由微动脉、微静脉、毛细血管和疏松结缔组织组成^［3-5］，遍布软骨骺，每一条软骨管构成一个相对独立的微小循环系统，维持特定区域软骨组织的代谢交换和内环境的稳定，参与软骨生长及次级骨化中心的形成^［6，7］。本研究用he染色结果提示软骨管来源、分布与上述观点相近，而组织化学染色方法及电镜观察首次证实部分软骨管除有微动脉、微静脉和毛细血管外，还由淋巴管构成，淋巴管是软骨管的重要组成部分。

　　对软骨内淋巴管的认识，有一个逐渐深入的过程。有学者应用淋巴管或血管注射等方法研究软骨与骨组织，认为其中没有淋巴系统^［8］。vetter等^［9］和werner等^［10］分别报道淋巴管内皮细胞的5’-核苷酸酶组织化学染色方法，可区分注射法无法充填的毛细淋巴管。rudert等^［1］和petersen等^［2］使用该方法，分别发现儿童椎间盘软骨板、膝半月板中存在淋巴管。本研究观察到胎儿和新生儿胫骨近端骨骺中存在淋巴管，具有以下特点：

　　1.胫骨近端骨骺软骨内的淋巴管来自软骨膜和交叉韧带。有学者报道骨膜、软骨膜及交叉韧带内存在淋巴管^［2］。关于骨骺软骨管的形成，大多数学者主张“主动侵入”理论，认为是软骨膜血管及周围结缔组织的主动伸延。本研究用he染色方法观察到胎儿骨骺软骨管于8～14周出现，之后逐渐增多，29周时数目最多，发育最完善，发育过程中部分骺软骨边缘的软骨膜内折凹陷，为软骨管的雏形，结构简单，深层的软骨管分支复杂，因此支持软骨管形成的“主动侵入”理论，也进一步说明骨骺软骨淋巴管的来源。

　　2.骨骺软骨中的毛细淋巴管由单层的内皮细胞构成，内皮极薄，胞浆中有大小不等的质膜小泡，基膜不完整或缺如，无周细胞，内皮细胞以重叠连接多见，有些保持开放状态，间隙达60nm，内皮外有锚丝，延伸到周围结缔组织中，部分同外周的胶原纤维相连呈松散网络，具有与其他组织内毛细淋巴管相同的形态特征。

　　3.骨骺软骨内的淋巴管参与软骨管的组成。胎儿早期骨骺软骨管单纯由血管组成，不包含淋巴管，胎儿中后期至新生儿胫骨近端骨骺约1/5的软骨管含有淋巴管，说明胎儿骨骺软骨管内淋巴管的发育迟于血管。

　　4.骨骺软骨内的淋巴管，在次级骨化中心出现之前，主要分布在生长板增殖带以上的软骨内，骺近中心部位较多。次级骨化中心出现后，淋巴管多分布于生长板的静止带和增殖带。胎儿中后期，生长板的生长化骨能力增强，加之次级骨化中心的形成，代谢旺盛，被称为“排液系统”的淋巴管具有较毛细血管更大的通透性，能够清除大分子代谢产物和坏死的细胞，辅助静脉回流，维持软骨组织正常的渗透压及结构平衡^［2，11］，保持骨骺软骨的生物力学特性。同时，新生儿骨骺生长板的血运屏障尚未建立，贯穿生长板的淋巴管有可能参与干骺端与骨骺之间的炎症、肿瘤的蔓延或扩散，在骨骺软骨疾病的演变过程中发挥作用。

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