血红素加氧酶1直接结合STAT3,在中

Hemeoxygenase‐1directlybindsSTAT3tocontrolthegenerationofpathogenicTh17cellsduringneutrophilicairwayinflammation

HO-1

血红素加氧酶-1

SnPP

锡原卟啉IX

RORγt

Rγ维甲酸相关孤儿核受体γt

STAT3

信号转导与转录激活因子3

SOCS3

细胞因子信号转导抑制因子3

吸入糖皮质激素，主要是皮质类固醇，是目前治疗哮喘最有效的方法。然而，在许多哮喘患者中，这种治疗方法无法阻止称为非嗜酸性哮喘（NEA）的严重哮喘或难治性哮喘的发展。NEA的特征是多形核中性粒细胞（PMN）数量增加，伴有与单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞相关的炎症反应。Th17细胞衍生的IL-17在NEA的发病机制和进展中起决定性作用。NEA患者血液、痰和气道中Th17细胞源性IL-17水平显著升高，而IgE水平没有升高。IL-17升高与气道高反应性（AHR）程度和NEA严重程度密切相关。

Th17细胞是产生IL-17、IL-21和IL-22的CD4+T细胞的一个亚群。IL-17促进气道上皮细胞释放IL-8，刺激气道上皮细胞产生粘液，增加气道平滑肌细胞的收缩和增殖，导致AHR。此外，IL-17介导免疫系统和组织细胞之间的相互作用，促进中性粒细胞性气道炎症的发生。Th17细胞与Th0细胞的分化涉及多种因素。TGF-β和IL-6是诱导Th17细胞分化的决定性细胞因子。IL-23维持Th17细胞的分化、存活和功能。维甲酸相关孤儿核受体γt（RORγt）是Th17细胞系中最关键的转录调节因子。RORγt的高表达诱导许多Th17相关基因的表达，如Il17、Il22和Il23R。此外，由IL-6和TGF-β联合诱导的RORγt表达主要通过激活信号转导和转录激活因子3（STAT3）介导。因此，IL-6/STAT3信号轴可以直接驱动Th17细胞分化。重要的是，IL-6还可以通过抑制Th0细胞向Treg细胞的极化来调节Th17细胞介导的免疫应答

细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3）是先天免疫和获得性免疫的关键生理调节因子，在JAK-STAT通路的负反馈调节中起着关键作用，参与T淋巴细胞分化和免疫应答的调节。SOCS3在幼稚T细胞中组成性表达。许多细胞因子如IL-6、IL-10、IL-1和TGF-β上调其表达。产生的SOCS3可抑制这些细胞因子诱导的信号通路，从而形成负反馈调节通路。SOCS3缺乏导致STAT3持续磷酸化，导致Th17细胞数量和IL-17A分泌显著增加。

血红素氧合酶-1（HO-1）参与血红素代谢过程的调节，其功能受到HO-1活性抑制剂Sn-原卟啉IX（SnPP）的抑制。对HO‐1的研究表明，HO‐1是一种保护性蛋白，在抗氧化和抗炎方面发挥着重要作用。它还可以调节平滑肌细胞增殖和细胞周期。在我们之前的研究中，我们发现HO‐1抑制Th17细胞分化并下调Th17介导的免疫应答，以重建体内Th17/Treg细胞的平衡，hemin是HO‐1的化学诱导剂，因此抑制卵清蛋白（OVA）诱导的NEA。内皮细胞和肝脏的研究缺血再灌注损伤表明HO-1通过激活STAT3信号通路发挥保护作用。然而，其他研究得出了相反的结论，表明HO-1对前列腺癌和移植诱导的肝缺血再灌注损伤的细胞保护主要是通过抑制STAT3来实现的，这些结果表明，HO-1在不同疾病中对STAT3有不同的调节作用。

在本研究中，我们通过研究HO‐1在调节IL‐6‐STAT3‐RORγt信号通路和Th17细胞介导的中性粒细胞气道炎症中SOCS3表达中的作用，进一步测试HO‐1如何抑制Th17细胞分化。到目前为止，还没有关于这些进程的报告。我们的数据为HO-1靶向因子提供了直接的实验证据，并为这种疾病提供了一种新的可能的治疗方法。

HO-1抑制Th17介导的免疫反应，减轻NEA患者的气道炎症

之前，我们报道了HO-1通过调节Th17介导的过敏反应中的Th17/Treg平衡发挥其保护作用。为了确定HO‐1对IL‐6‐STAT3信号的影响，这是诱导RORγt和随后Th17细胞分化所必需的，我们使用DO11.10转基因小鼠作为体内模型，其中OVA激发诱导中性粒细胞气道炎症。将小鼠随机分为4组：对照组、NEA组、NEA+Hemin组和NEA+SnPP组（每组5只），分别于Hemin或SnPP治疗后1、2、3天给予OVA激发。结果显示，NEA+Hemin组的肺和脾组织中观察到最高的HO-1蛋白水平。伴随着支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞（Gr-1+细胞）总数和频率的减少。此外，经氯化血红素治疗后，肺和支气管肺泡灌洗液中的IL-17A和IL-6水平显著降低。相反，IL-10作为一种抗炎细胞因子，能够抑制Th17介导的炎症反应，在用血红素治疗后，在肺和BALF中显著增加。血红素诱导的HO-1增加与炎症细胞浸润肺组织的减少有关。有趣的是，SnPP加重了Th17反应和气道炎症。总的来说，这些数据支持增加HO-1水平降低IL-17A和IL-6产生，但增加IL-10水平，从而抑制NEA中Th17免疫应答的观点。

HO-1抑制NEA中RORγt和SOCS3的表达

接下来，为了确定HO‐1如何调节NEA小鼠模型中Th17介导的免疫应答过程，我们测量了一次、两次或三次OVA激发后的细胞因子水平。在所有组中，肺和BALF中的IL-17水平逐渐升高，这取决于OVA激发治疗的持续时间。有趣的是，IL-10在血红素给药开始时最高，然后在治疗过程中逐渐降低。然而，HO‐1上调抑制了IL‐17A产生的增加，并将IL‐10维持在高水平。

为了探讨转录调节因子RORγt和负反馈调节因子SOCS的可能调节作用，我们检测了肺组织提取物中RORγt、SOCS1和SOCS3的表达。在OVA组，RORγt和HO-1水平随着治疗的进行而逐渐升高。在OVA+SnPP组中，RORγt和HO-1的水平与OVA组相似，但在OVA+Hemin组中，RORγt和HO-1之间呈负相关。正如预期的IL-6-JAK-STAT3通路的关键反馈调节器一样，OVA和OVA+SnPP组的SOCS3水平也显著升高，但在OVA+Hemin组中没有升高。相比之下，任何一组的SOCS1均无显著变化。这些数据表明，在NEA模型中，HO-1可能作用于RORγt的上游活化途径，而不是负反馈调节因子SOCS3。

HO‐1抑制IL‐6‐JAK‐STAT3途径的信号分子以阻止Th17细胞分化

为了研究HO‐1在NEA模型中对RORγt上游因子的分子调控机制，我们测定了Th17诱导条件下JAK‐STAT3通路的信号蛋白水平。在分析之前，各组纯化的原始T细胞在体外用OVA-处理24小时。STAT3的磷酸化（Tyr）被用作STAT3活化的标志物。在对照组小鼠的CD4+T细胞中，即使STAT3处于激活状态，RORγT的表达也很低。在NEA+Hemin小鼠的CD4+T细胞中，HO-1的上调伴随着RORγT和SOCS3水平的降低。此外，相同细胞中STAT3的磷酸化显著受到抑制。在任何一组中，JAK2激活没有变化。在Th17细胞相关基因中，用氯化血红素治疗后，RORγt、IL-17A和SOCS3的mRNA水平也显著降低。这些结果表明HO‐1抑制STAT3的磷酸化，导致NEA模型中RORγt和SOCS3水平降低。我们进一步检测了IL-6-JAK-STAT3信号通路中IL-6R和IL-23R的水平，IL-6-JAK-STAT3信号通路影响STAT3的磷酸化并特异性地驱动Th17细胞分化。在野生型（WT）BALB/c小鼠中通过腹腔注射血红素连续两天诱导HO-1表达，然后分离CD4+T细胞。氯化血红素处理对这些细胞中IL-6R或IL-23R的表达没有影响

接下来，我们检测了HO-1在体外对Th17分化的影响。MACS使用从WT-BALB/c小鼠脾脏分离的幼稚T细胞。我们发现血红素可上调幼稚T细胞中HO-1的表达；峰值表达出现在72小时并持续96小时。此外，在Th17倾斜分化条件下，血红素治疗后5天，Th17细胞的数量和IL-17A的水平较低。有趣的是，在氯化血红素处理的细胞中，从处理后72小时开始观察到IL-17A的产生减少，并维持到5天。在相同条件下，HO-1显著抑制STAT3和SOCS3表达的磷酸化。这些数据表明，HO‐1主要通过抑制Th17倾斜分化条件下的STAT3磷酸化来抑制Th17细胞分化。

HO-1通过下调STAT3磷酸化抑制Th17细胞分化

为了研究HO‐1如何调节STAT3活化以抑制RORγt表达，我们分析了HO‐1在IL‐6‐STAT3‐RORγt/SOCS3信号通路中的动态调节。血红素处理后24小时，STAT3磷酸化降低后，RORγt表达受到抑制；这种作用持续5天。在相同条件下，SOCS3也被抑制。此外，在不同时间点测定了IL-6刺激的幼稚T细胞中STAT3磷酸化。结果显示，血红素治疗后2小时HO‐1的上调可降低IL‐6‐STAT3信号通路中的STAT3磷酸化，尽管IL‐6和血红素刺激均增加了STAT3水平。因此，这些结果表明诱导型HO-1抑制了STAT3的激活。

为了进一步验证HO‐1而非血红素对Th17倾斜分化下STAT3激活的直接抑制作用，在连续两天给予血红素之前，通过尾静脉注射用HO‐1siRNA转染WT‐BALB/c小鼠。结果表明，5OD（nmol）或8OD（nmol）HO-1siRNA均可显著抑制血红素诱导的HO-1在幼稚T细胞和肺组织中的表达。然后分离纯化用HO-1siRNA（5OD）和氯化血红素（75μmol/kg）处理的WT-BALB/c小鼠的幼稚T细胞，随后培养5天。结果表明，HO‐1siRNA显著抑制血红素诱导的HO‐1表达。纯化的原始T细胞在Th17倾斜分化条件下培养5天。测定与Th17途径相关的信号蛋白水平，发现HO-1的抑制功能被HO-1siRNA抑制，其中STAT3磷酸化和RORγt表达均增加。然而，无论HO‐1siRNA或血红素处理如何，都无法检测到JAK1和JAK2的激活。这些数据表明STAT3磷酸化的抑制归因于HO-1对STAT3的作用。

HO-1结合STAT3的三个位点以下调其磷酸化

上述研究表明HO-1通过下调STAT3的磷酸化来抑制Th17细胞的分化。为了描述HO-1和STAT3之间的相互作用，从DO11.10小鼠分离的脾细胞单独用OVA或用含血红素的OVA处理以获得高水平的内源性HO-1。结果表明，HO-1的高表达主要与STAT3相互作用，而不是JAK1或JAK2。将含有HO‐1和STAT3结构域的质粒共转染T细胞，以确定HO‐1和STAT3结构域之间的相互作用位点。结果表明，HO-1可以与STAT3的三个位点相互作用：DNA结合域、连接域和反式激活域。

接下来，我们通过制备四种STAT3突变体，即M‐RW（DNA结合结构域）、M‐KA（连接结构域）、M‐YF（反式激活结构域）和M‐3SITES（所有上述结构域），来评估与HO‐1结合的这三个关键结构域的作用。结果显示，IL-6处理1小时后，在EL-4细胞中STAT3WT的表达高度激活，但HO-1的上调显著逆转了这种效应。这一结果表明HO-1的上调作用于STAT3Tyr磷酸化。由于共免疫沉淀分析显示HO-1也可以与STAT3的DNA结合域和连接域对接，我们进一步分析了这三个域的功能以及通过HO-1与这些域的相互作用对STAT3Tyr磷酸化的影响。将STAT3突变质粒（M‐RW、M‐KA、M‐YF和M‐3SITES）和HO‐1表达质粒共转染到T细胞中，以检测这些突变体结合HO‐1的能力。有趣的是，我们发现HO‐1仍然与单位点突变的M‐RW、M‐KA和M‐YF结合，但在三位点突变的M‐3位点中HO‐1的结合被抑制，这表明STAT3在使用多个位点结合HO‐1时存在冗余。然而，与M‐RW或M‐KA相比，M‐YF中Tyr磷酸化水平显著降低，表明STAT3的DNA结合域和连接域是主要的“锚定域”。

为了确定STAT3是否是HO‐1负性调节Th17细胞分化的关键直接靶点，我们接下来制备了一种在A和N位点携带双突变的STAT3突变体，并将这种组成性STAT3激活突变体构建到pCMV中（命名为STAT3M‐/），它产生一个自发二聚的分子，与DNA结合，甚至在没有Tyr磷酸化的情况下也能激活转录。将HO‐1和STAT3M‐/质粒共转染EL‐4细胞并培养48小时，在IL‐6刺激24小时后测定与Th17分化相关的STAT3下游信号蛋白水平。结果表明，HO-1能够抑制STAT3WT诱导的RORγt和SOCS3的表达。相反，即使在IL-6刺激下，STAT3M-/也能显著促进RORγt和SOCS3的表达。此外，HO‐1仍然与STAT3M‐/结合，但未能抑制导致RORγt和SOCS3高表达的这种组成性突变体的激活。综上所述，这些数据证实了HO-1对STAT3的直接失活对其免疫抑制作用起着至关重要的作用。

HO‐1siRNA抑制HO‐1的保护作用并加重NEA中Th17的反应

最后，为了验证血红素诱导的HO-1而不是其他潜在因子在小鼠NEA模型中的保护作用，在血红素治疗前通过尾静脉注射将FAM标记的HO-1siRNA转染到动物体内。虽然在已建立的NEA小鼠模型中仍能观察到肺组织中FAM的表达，但HO-1的作用被HO-1siRNA逆转，BALF中Gr-1+细胞的频率增加和气道炎症的加重是明显的。我们进一步研究了这些IL‐6‐STAT3‐RORγt/SOCS3信号分子在Th17细胞分化中的水平，发现注射HO‐1siRNA的小鼠的STAT3磷酸化水平（RORγt和SOCS3）高于注射hemin的小鼠。此外，HO‐1siRNA治疗增加了IL‐17A水平，但减少了IL‐10的产生。这些结果证明HO-1在NEA模型中通过阻断STAT3磷酸化发挥了本质上的保护作用。

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