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流式细胞术检测外周血淋巴细胞的前处理
流式细胞术检测外周血淋巴细胞的前处理
1单细胞悬液的制备
血液(Blood)的制备
裂红细胞：8mL水+1mL1%BSA（预先加入15mL离心管中），取μL血液+30μL肝素钠于1.5mL离心管漩涡振荡后加入15mL离心管中，反复颠倒混匀30s，加入1mL1×PBS终止；
rpm4℃离心5min，弃上清，转到1.5mL离心管，过目尼龙膜；
rpm4℃离心5min，真空泵吸掉上清，加1mL1%BSA（细胞培养液，PBS），重悬。
脾脏(Spleen)和骨髓(Bonemarrow)的制备
用六孔细胞培养板，每个孔装3mL1%BSA，取出脾脏和大腿骨，放入培养板，冰上处理；
用尼龙膜和研磨棒研磨脾脏以及用5mL1%BSA冲出骨髓，转到15mL离心管（8mL水+1mL1%BSA）；
rpm4℃离心5min，弃上清，加2mLACK裂红2min（吹打混匀后开始计时），加1mLPBS终止；
rpm4℃离心5min，弃上清，过目尼龙膜，转到1.5mL离心管；
rpm4℃离心5min，真空泵吸掉上清，加1mL1%BSA，重悬。
外周淋巴结和肠系膜淋巴结的制备
用六孔细胞培养板，每个孔装3mL1%BSA，取出脏器，放入培养板，冰上处理；
rpm4℃离心5min，弃上清倒掉，转到1.5mL离心管，过目尼龙膜；
rpm4℃离心5min，真空泵吸掉上清，加1mL1%BSA，重悬。
2
细胞染色
表面染色
分出1×个细胞，每个样本rpm离心5min，用真空泵吸去上清；
加入流式mix抗体，吹打混匀后，冰上避光30min；
加入μLPBS，rpm离心5min，真空泵吸取上清；
加入μL（细胞培养液，PBS）重悬，转到流式管中上机检测。
胞内染色
LPS：细胞脂多糖内毒素。
GLogiStop：高尔基阻断剂，细胞因子不分泌出胞外，都保存在细胞器中。
PMA：蛋白激酶激活剂，可以刺激淋巴细胞相关蛋白磷酸化，导致T细胞分泌量增加。
ION：钙离子转运剂，为蛋白激酶，活化信号通路。
LPS+GLogiStop:树突细胞、巨噬细胞、粒细胞
PMA+ION+GLogiStop:T细胞
分装2×个细胞，rpm离心5min，弃上清，用ICS细胞培养液重悬起来；
根据相应的细胞加刺激物，每个刺激物都加入10μL，刺激4-5小时；
收细胞：rpm离心5min，真空泵吸弃上清；
加入20μL表染抗体，冰上避光30min（抗体浓度加倍）；
加入μL1×PBSrpm离心5min，真空泵吸弃上清；
加入μL破膜固定液冰上固定20-25min；
加入1×WashBufferμL，rpm离心5min，真空泵吸弃上清；
加入50μL胞内染色抗体，冰上避光30min；
用μL的1×WashBufferrpm离心5min，真空泵吸弃上清；
用μL1×PBS重悬，4℃避光保存，最多1周；
转移到流式管，转移时用目尼龙膜过滤，上机检测。
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