项目文章单细胞测序揭示MeCP2缺陷小鼠

年01月10日，医院儿保科徐秀教授团队于FrontiersinImmunology（IF:8.）在线发表了一篇关于单细胞测序揭示MeCP2缺陷小鼠脑膜免疫细胞异质性的最新研究成果。研究表明甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）基因突变是Rett综合征的主要致病原因，因此作者通过单细胞测序探索了Mecp2缺陷小鼠脑膜的免疫细胞景观，提供了对脑膜免疫的新见解，可以更好地了解脑膜免疫在RTT中的作用。

期刊：FrontiersinImmunology

影响因子：8./Q1

发表年月：-01-10

材料：小鼠-脑膜

方法：10xGenomics单细胞3端测序

研究背景

Rett综合征（Rettsyndrome，RTT）是一种以女性发病为主的神经系统发育障碍疾病，属于X染色体连锁神经发育性疾病，临床特征表现为智力低下、语言功能丧失、手部刻板动作、步态异常等，该疾病临床上尚无有效的治疗手段。甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）基因突变是Rett综合征(RTT)的主要致病原因。越来越多的证据表明免疫失调和慢性亚临床炎症与MeCP2缺陷密切相关，并导致RTT的发展和恶化。中枢神经系统(CNS)周围的脑膜包含广泛的免疫细胞库，它们参与CNS内的免疫监视并影响各种脑功能；然而脑膜免疫在MeCP2缺陷CNS中的特征和作用仍然没有得到很好的解决。

研究结果

Mecp2缺陷小鼠的RTT样表型

Mecp2-null小鼠表现出RTT样表型，包括明显的生长迟缓、后肢抱紧和出生后预期寿命短（图1A-C）等；此外观察到Mecp2缺陷小鼠的脑膜淋巴管缺陷，表现为脑膜淋巴管直径减小（图1D-E）。由于脑膜淋巴管在CNS免疫细胞的发育和再循环中发挥重要作用，因此这些结果表明Mecp2缺陷小鼠的脑膜免疫力可能发生了改变。

图1

脑膜免疫细胞多样性

为了描绘Mecp2缺陷小鼠脑膜免疫细胞的变化，从Mecp2缺陷和WT小鼠中获得脑膜细胞悬液，用CD45进行免疫细胞分选用于单细胞转录组测序。Mecp2-null小鼠获得个细胞，WT小鼠获得个细胞（图2A），这些免疫细胞聚类获得18个clusters，包括巨噬细胞、B细胞、树突状细胞（DCs）、单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞、T细胞、ILC-2细胞和NK细胞（图2B、C）。此外，Mecp2-null小鼠表现出巨噬细胞减少和B细胞增加（图2D）。同时，免疫球蛋白相关基因，如Ighg2c,Igha,Ighg2b,Igkc,Iglc2,Iglc1,Iglc3等，在Mecp2-null小鼠中显著上调表达（图2E）；上调基因在免疫功能中显著富集（图2F）。

图2

脑膜B细胞活性分析

尽管在Mecp2缺陷小鼠脑膜中B细胞发生显著变化，但其在稳态下的特征知之甚少。作者通过流式观察到Mecp2缺陷小鼠脑膜中B细胞群增加（图3A）。为进一步探索B细胞群，将其重新聚集，聚成七个细胞亚群（C1-C7）（图3B），其中C2和C3细胞亚群在两组之间相反（图3C）。7个细胞亚群形成了B细胞的连续发育轨迹，其中成熟B细胞（C1和C3）中Ighd、Ighm和Ms4a1高表达；未成熟B细胞(C2)中Ighm高表达，但Ighd不表达；cyclingpre-B细胞（C4和C5）中，Top2a、H2afx和Mki67上调表达；Pre-B细胞(C6)高表达Vpreb1、Vpreb3、Dntt、Lef1和Rag1；而浆细胞(C7)高表达Prdm1和Il10(图3D)。在Mecp2缺陷小鼠中，细胞亚群MatureB_C2中高表达B细胞活化标记基因，如Cd83、Egr3、Fcer2a、Myc和Cxcr5（图3E）。与细胞亚群MatureB_C1相比，转录因子Kdm2b、Rel和Crem在细胞亚群MatureB_C2中的转录活性较高（图3F）。

图3

T细胞活化分析

为了更好地了解Mecp2缺陷小鼠中的T细胞活化，作者将ILC2、NK细胞和T细胞重新聚类为七个细胞亚群。通过marker基因进行细胞亚群鉴定，以Cd3e和Cd4表达特征的CD4T细胞(C1)；以Cd3e和Cd8表达特征的CD8T细胞(C2)；ILC2s(C3)以Gata3为表达特征；NK细胞(C4)中Nrc1和Klrd1高表达，Cd3e不表达；NKT(C5)以Cd3和Klrd1为表达特征；regulatoryT(Treg、C6)以Cd3e、Cd4和Foxp3为表达特征；γδT细胞(C7)以Cd3e和Tcrg-C1为表达特征（图4B）。在Mecp2缺陷小鼠中，CD4T细胞、CD8T细胞、NK和NKT细胞占比相对较高（图4C）。

图4

T细胞中的IFN-γ转录和细胞通讯分析

IFN-γ是II类干扰素的唯一成员，在先天免疫和适应性免疫中起着关键作用。分析结果表明：在Mecp2缺陷小鼠的CD8T细胞中Ifng高表达；CD8T、CD4T和NKT细胞亚群也表现出Ifng高表达（图5A、B）；免疫荧光结果与其一致（图5C、D）。细胞通讯分析表明：Mecp2缺陷小鼠表现出更复杂的IFN-II信号通路网络变化（图5F、G）。

图5

巨噬细胞活化以及拟时序分析

为分析巨噬细胞活性，作者将巨噬细胞群重新聚类为五个细胞亚群（图6A、B）。Subclusters1、2和5属于MHCII低表达组，表现出Lyve1和Gas6高表达；而Subclusters3和4属于MHCII高表达组，表现出H2-Aa和Cd72高表达（图6C）。作者对巨噬细胞进行拟时序分析，Mecp2缺陷小鼠的细胞轨迹模式从state1转化到state7（图6D、E），预测基因被聚集成模块，揭示了在拟时序过程中基因的转录梯度发生了丢失或获得（图6H）。

图6

总结

单细胞测序结果描绘了Mecp2缺陷小鼠脑膜的免疫细胞景观。Mecp2缺陷小鼠脑膜表现出更高的免疫细胞群多样化，B细胞明显多于对照小鼠，免疫球蛋白相关基因的表达显着更高，且含有更多的细胞毒性CD8T细胞。随着T细胞和NK细胞中IFN-γ转录的增加，Mecp2缺陷小鼠中脑膜巨噬细胞的抑制减少、活性增加。这些发现提供了对脑膜免疫的新见解，可以更好地了解脑膜免疫在RTT中的作用。

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