放疗专题放疗后肿瘤细胞重塑炎症微环境

肿瘤可以分为免疫“冷”肿瘤和免疫“热”肿瘤。免疫抑制与慢性干扰素信号有关，而免疫排斥与β-连环蛋白和转化生长因子β(TGFβ)等途径有关。突变或新抗原负荷较低的肿瘤对ICIs的反应较差，即使是具有高水平肿瘤突变(导致更多肿瘤新抗原)和免疫细胞浸润的所谓“热”肿瘤也可能对ICIs表现出较差的反应。然而，最近的研究表示由DNA损伤驱动的肿瘤细胞内在事件是放射治疗免疫调节作用的核心。这种肿瘤细胞自主效应及其如何指导未来的治疗组合是本综述的重点。

辐射对肿瘤间质有直接影响，包括对癌症相关成纤维细胞(CaF)、血管和免疫细胞。

新的数据表明，驻留于肿瘤的T细胞对放射疗法有抵抗力。在临床前模型中，淋巴结中的CD8+T细胞对放疗更加敏感。放疗对血管密度和功能也有严重的不良影响。ATR抑制逆转了小鼠放疗导致的血管密度下降。目前尚不清楚，在放疗后炎症的情况下，如何控制血管面积和通透性减少以及缺氧增加之间的平衡，以获益。CAFs在肿瘤中具有免疫抑制作用，并且可以通过分泌转化生长因子-β（TGFβ）来促进放疗抵抗干细胞表型来促进放疗抵抗。CAFs还分泌外泌体，通过维甲酸诱导基因I(RIG-I)与肿瘤细胞相互作用，进一步促进放疗抵抗。更广泛地说，辐射后的CAFs产生的DNA损伤信息的分泌体被认为具有多种作用，包括通过上皮-间充质转化促进肿瘤细胞生存和增加β1整合素的表达。

本综述总结了放疗诱导的肿瘤基因组断裂是如何通过胞质核酸传感器引发炎症反应的。这是在DNA损伤反应(DDR)抑制剂领域的新研究背景下讨论的，并以肿瘤细胞为中心，信号向肿瘤微环境的传播是通过肿瘤细胞产生细胞因子以及由环状二核苷酸环状GMP-AMP(CGAMP)产生的间接免疫刺激信号实现的。放疗引起的DNA损伤和基因转录改变可以调节肿瘤新抗原的表达。这些事件导致先天和/或适应性抗肿瘤免疫启动的激活。本综述重点介绍如何利用这些肿瘤细胞自主特性来合理指导DDR抑制剂和ICIs与放疗的新组合。

1、辐射后肿瘤细胞胞质核酸传感

（1）辐射通过cGAS-STING诱导细胞质DNA感应

胞质核酸传感器最初被描述为细胞内模式识别受体，可启动对病毒和其他病原体感染的先天免疫应答。最近对循环肿瘤细胞中的DNA损伤可以激活这些细胞内传感器的发现，已经改变了我们对放射治疗作为抗癌机制的理解。胞质DNA感应环状GMP-AMP合酶（cGAS）-干扰素基因（STING）途径的活化在此过程中似乎在表型上占主导地位。这些发现对基因组不稳定性(辐射诱导的DNA损伤的反应)如何影响炎症反应有重大意义。

（2）通过cGAMP和外泌体传递肿瘤细胞胞内和胞外信号

来自肿瘤细胞胞质的cGAMP可以通过间隙连接扩散到相邻细胞。最近的研究发现cGAMP在细胞外的形式主要来源于肿瘤。哺乳动物的cGAMP被外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ENPP1）降解，这是一种以膜结合和裂解的可溶形式存在的胞外酶。通过敲低或抑制ENPP1活性丧失可增强放疗的疗效。与发现细胞外cGAMP的重要性同时，SLC19A1是最近识别的第一个已知的cGAMP的输入因子，并显示了一个尚未确定的ATP依赖的cGAMP输出通道或转运子的存在。除cGAMP外，外泌体在免疫刺激细胞间信号传导是另一种机制。辐射会改变肿瘤来源的外泌体的组成。例如，辐射后产生的肿瘤源性外泌体可以将免疫刺激肿瘤DNA运送到树突状细胞(DCs)。

（3）辅助因子和翻译后修饰调节cGAS和STING的激活

①与其他核酸传感器相比，cGAS–STING途径同时受到正向/负向调节。

除cGAS外，NOD样受体家族CARD结构域3（NLRC3），IFNγ诱导蛋白16（IFI16）和DEAD-box解旋酶41（DDX41）均与dsDNA结合，对STING介导的I型IFN信号具有积极的作用。NLRC3通过隔离与STING结合并阻断STING活性，dsDNA与NLRC3结合有利于STING的释放。IFI16可以通过两个HiN结构域结合DNA，随后通过一个吡啶结构域与STING相互作用。总的来说，文献表明IFI16-STING相互作用可增强对cGAMP的STING依赖性IFNβ的产生。

DDX41可以结合dsDNA。Bruton的酪氨酸激酶（BTK）介导的DDX41磷酸化促进dsDNA与DDX41的结合，而E3泛素连接酶TRIM21通过泛素化和降解来负调控DDX41。DNA与DDX41的结合导致DDX41与STING的结合并增强了下游I型IFN的产生。

②cGAS和STING都需要进行广泛的翻译后修饰，以调节活性。

（4）caspases对cGAS-STING的负调控

①细胞质DNA激活cGAS–STING与炎症小体之间的正串扰和负串扰的炎症小体信号通路。cGAMP或IFNβ上调AIM2，含NACHT，LRR和PYD结构域的蛋白3（NLRP3），半胱天冬酶1，白介素1β（IL-1β）和Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）。②STING的负调控似乎集中于caspase的激活。半胱天冬酶1可以直接分解和灭活cGAS。半胱天冬酶1也裂解并激活胃泌素D。这会在细胞膜上形成一个K+外排孔，从而负向调节cGAS活性。③凋亡的caspase活化还可以负调控cGAS–STING途径。Caspase3裂解cGAS，干扰素调节因子3（IRF3）和线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS），如果cGAS与DNA结合，则裂解作用增强。半胱天冬酶3（Casp3基因敲除）的丧失由于对小鼠单独放疗或与抗CTLA4联合治疗提高了I型IFN的产生。总之，这些研究表明，cGAS–STING与caspase活性之间存在大量的相互作用，从而调节了对胞质dsDNA诱导的炎症反应。

（5）RNA传感器的串扰

放疗后小鼠肿瘤细胞中的许多核酸传感器上调，包括RNA传感器和模式识别受体视黄酸诱导型基因I（RIG-1；也称为DDX58）和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5；也称为如IFIH1）。在DNA感应通路和细胞质RNA感应通路之间已经鉴定出一定程度的串扰。已经证明，MAVS和RIG-1对于实现放射疗法诱导的I型干扰素最大产生是必要的。放疗可诱导内源性小非编码RNA(sncRNAs)、来自信号转换器和转录激活因子1(STAT1)下游内源性逆转录病毒元件(ERVs)的dsRNA和5-三磷酸部分RNA(由富含AT的dsDNA的DNA依赖RNA聚合酶III合成)。最近发现是通过辐射依赖的解旋酶LGP2(也被称为DHX58)诱导I型IFN信号通路的促进生存和负调控。这是通过LGP2与MAVS下游的TNF受体相关因子2（TRAF2），TRAF3，TRAF4和TRAF6相互作用介导的。LGP2负调控I型IFN和NFκB信号通路下游的RNA传感器和cGAMP介导的STING激活。

2、放射治疗和DDR的联合

（1）cGAS对微核的监测

放射疗法在癌细胞中诱导微核形成是一个众所周知的现象，DNA损伤诱导或辐射诱导的I型IFN产生也是如此。cGAS定位于破裂的微核的发现将辐射研究联系在一起。干扰素刺激基因（ISG）转录本仅以cGAS依赖和STING依赖的方式存在于微核细胞中。cGAS对DNA修复的直接抑制可能促进微核的形成，而STING激活诱导WIPI2依赖性和ATG5依赖性的微核和胞质DNA的自噬清除。STING下游的自噬和NF-κB活化被认为是在干扰素信号传导之前存在进化保守功能。

（2）干扰素病和DNA修复缺陷性癌症

cGAS–STING信号转导的缺陷已在诸如STiNG相关性血管病，婴儿期发作（SAVI）和Aicardi-Goutières综合征（AGS）的疾病中得到鉴定。AGS和SAVI是干扰素病，是通过慢性干扰素产生而机械性联系在一起的一组自身炎症性疾病。共济失调的毛细血管扩张突变（ATM），Artemis和Bloom综合征蛋白（BLM）的基因突变导致与胞质DNA相关的ISGs上调。DDR信号与I型干扰素直接上游信号之间不可分割的联系对我们理解癌症生物学和癌症治疗有影响。具有BRCA或Fanconi贫血途径突变的DDR缺陷乳腺癌患者样本含有更高的T细胞浸润。含有缺陷DNA修复途径的癌症，在合成致死率的概念驱动下，刺激了许多DDR抑制剂的发展。

（3）DDR抑制剂和放射增敏

G1细胞周期检查点控制和同源重组修复(HRR)中与癌症相关的DDR缺陷被视为药物的可开发特性。这种方法导致了针对BRCA1或BRCA2缺陷和检查点激酶1(CHK1)、WEE1和共济失调毛细血管扩张症的癌症的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂的开发，以及防止DNA损伤后S和G2/M细胞周期停滞的Rad3相关蛋白(ATR)抑制剂。还开发了其他放射增敏方法，如通过DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)抑制非同源末端连接，或通过抑制伴侣蛋白HSP90减少CHK1、ATR和RAD51。ATR和WEE1激酶是放射治疗后细胞周期停滞的关键成分。用辐射和ATR抑制剂AZD处理的癌细胞显示G2停滞的消除与微核的产生一致，微核具有核膜破裂的特征。对小鼠的研究表明，ATR抑制增强了辐射诱导的I型干扰素反应，显著增强了免疫细胞浸润。在体外，WEE1抑制结合放疗增加了细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)对肿瘤细胞的颗粒酶B依赖性杀伤。在放射治疗中加入PD-L1并抑制WEE1显著增加了MOC1同基因小鼠头颈鳞状细胞癌模型的存活率。用这种三重组合观察到最大的T细胞肿瘤抗原特异性反应。自然杀伤(NK)细胞对肿瘤细胞的杀伤也通过单独抑制WEE1而增强。ATR是DNA复制应激反应的激酶。ATM是负责对DNA双链断裂（DSB）进行总体细胞反应的顶端激酶。ATM丧失或抑制可增强放射疗法诱导I型IFN的产生。结合抗PD-L1可以提高ATM联合放射疗法的功效，三联组合可显着改善CD8+T细胞的浸润。抑制PARP是具有HRR缺陷的合成致命性的，这种合成致死率可能与I型IFN信号密切相关。DNA切除修复蛋白ERCC1也与PARP抑制剂的敏感性有关。非小细胞肺癌（NSCLC）中的ERCC1表达与大量肿瘤浸润淋巴细胞相关，而与野生型相比，PARP抑制在ERCC1缺陷细胞系中诱导更高的cGAS阳性染色质片段和I型IFN信号传导。在野生型HCT结肠癌细胞中，PARP抑制引起的放射增敏作用显着增加了ISG表达。根据这些数据，HRR蛋白RAD51的耗竭和放射疗法会导致细胞质DNA，STING活化以及IL6和TNF转录产物的产生。

3、辐射后肿瘤细胞对抗原呈递的影响

（1）辐射诱导的肿瘤相关新抗原呈递

核酸传感器的激活触发I型IFN和炎性细胞因子的产生。这通常被称为“病毒模仿”，具有刺激抗肿瘤CD8+T细胞反应的潜力。添加ICI可能将此作用扩展至未受辐照的远端病变，称为远隔效应。但是，通过细胞毒性CD8+T细胞消除细胞需要识别靶细胞表面主要组织相容性复合物i（MHC-1）上呈现的抗原。在这方面，已经证明放射疗法既可以增加也可以调节癌细胞上的抗原呈递。辐射增加了肿瘤细胞表面的MHC-1表达。DDR抑制剂的添加可以进一步增加辐射诱导的肿瘤细胞MHC-1表面表达。辐射扩大了细胞内肽库，改变了MHC-I相关肽谱，同时增强了体内MHC-SiiNFeKL所显示的现有肽呈递水平。CTLA4阻断联合放疗诱导化疗难治性转移性非小细胞肺癌全身抗肿瘤T细胞。在一名完全缓解的患者中，新抗原预测确定了KPNA2的突变，KPNA2基因表达通过放疗上调。对应于突变型而非野生型KPNA2的肽导致患者CD8+T细胞产生IFNγ。据推测，这种干扰素γ可能引发抗原扩散。

（2）辐射产生的新抗原和T细胞受体库

现在已经公认，突变负荷和肿瘤新抗原负荷通常可以预测对ICI的临床反应。癌症可能通过暴露于诱变剂（例如紫外线和吸烟），DNA修饰和复制错误（通过APOBEC3B表达或POLE或POLD1突变）或遗传性或获得性DNA修复缺陷而产生高突变负荷。DDR途径中基因的体细胞变异和表观遗传沉默在许多癌症类型中普遍存在。这组患者的肿瘤可能同时具有高突变和新抗原负担以及胞质DNA驱动的炎症信号。辐射增加了独特的TCR和T细胞克隆性的数量，还需要额外的抗PD-1治疗，以将这种增加的多样性扩展到辐射场之外的肿瘤部位。临床前数据表明，基础可检测的MHC-1肽（例如SIINFEKL，AH1或CEA）的抗原呈递增加，对放射治疗和ICI组合是有益的。

4、辐射重塑肿瘤细胞后对肿瘤免疫微环境的影响

（1）放疗对树突状细胞的影响

①人类乳头瘤病毒（HPV）驱动的癌症模型还证明了放射疗法有助于基于HPVE7的疫苗接种，辐射剂量依赖性地增加DC成熟和肽特异性T细胞应答。②免疫原性细胞死亡与损伤相关分子模式（DAMP）的释放相对应，例如钙网蛋白，高迁移率族1号框（HMGB1）和ATP，所有这些都通过放疗得以增加。③TLR4激活从肿瘤细胞释放HMGB1，通过阻断吞噬体的溶酶体降解来促进DC呈递抗原。④已证明CD11c+CD8α+BAT疗效F3-谱系DC是放疗和抗CTLA4应答的关键，而小鼠CD11c+DC上IFNAR1的缺失会逆转疗效。⑤释放到肿瘤微环境中的ATP结合DC上的P2X7嘌呤能受体，导致IL-1β通过NLRP3释放。已证明这是引发小鼠中产生IFNγ的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞所必需的。

（2）对T细胞浸润的影响

①放射治疗与DC功能的影响平行，可促进T细胞浸润所需的细胞因子分泌。②辐射诱导肿瘤细胞固有的CXCL16分泌，该CXCL16与T辅助1（TH1）细胞和活化的CD8+T细胞上的C-X-C型趋化因子受体6（CXCR6）结合。T细胞趋化因子CXCL9和CXCL10与T细胞上的CXCR3结合。③CHK1抑制剂或PARP抑制剂在体外诱导小细胞肺癌（SCLC）细胞系中STING依赖性CXCL10转录。④在T细胞浸润时，MHC-I、ICAM1、RAE-1γ和NKG2D在T细胞阻滞、肿瘤细胞参与以及放疗和抗CTLA4联合治疗小鼠的疗效中发挥作用⑤调节性CD4+FOXP3+T细胞(Treg细胞)在放疗后的小鼠肿瘤中也增加，并通过ATR抑制进一步升高。Treg细胞通过CTLA4信号传导、TGFβ和IL-10的产生以及CD39和CD73将ATP转化为腺苷来促进免疫抑制，大量文献表明靶向Treg细胞联合放疗可能是有益的。

（3）对抑制性髓细胞群的影响

经典的炎性单核细胞在炎症过程中被募集到组织中，在这些组织中，它们可以分化为巨噬细胞或DC，这些巨噬细胞或DC可以表现出促炎或抗炎特性，具体取决于细胞因子的环境。这种免疫抑制群体获得了别名髓系来源的抑制细胞(MDSCs)。辐射会增加CCL5和CCL2的产生，从而驱动CCR2+CCR5+炎性巨噬细胞在小鼠肿瘤内和循环中的浸润。CCR2和CCR5拮抗剂逆转了这种辐射诱导的增加并增强了辐射疗效。

（4）肿瘤细胞与免疫细胞对I型干扰素的反应

辐射诱导或外源性IFNβ对于肿瘤控制至关重要，并且依赖于非肿瘤细胞，特别是CD11c+DC上的IFNAR。但是，ISG的现有表达可预测许多人类癌症对放射线和/或化学疗法的抵抗力。最近的证据表明，这是由肿瘤细胞上的自分泌或旁分泌的I型IFN信号驱动的。

在多种癌症类型中，患有T细胞浸润但存在T细胞功能障碍标志物的患者，肿瘤表现出与干扰素反应相关的通路上调。在小鼠模型中，Ifnar1基因敲除或Janus激酶（JAK）抑制作用增强了肿瘤对放射的反应，这是因为CD8+T细胞介导的细胞杀伤增加与SERPINB9的减少有关。放疗、DDR抑制剂和ICI组合可能只对低ISG信号的肿瘤有效，而无需添加靶向肿瘤IFNAR1信号的抑制剂。

1、放射治疗和免疫检查点抑制剂试验

大量辐射加ICI联合研究目前正在招募患者。在大量的第一阶段研究表明放射治疗加免疫抑制综合治疗是安全的，进一步的研究正在调查在不同患者群体中同时进行免疫治疗和放化疗的益处。

①PACIFIC试验显示，对未经切除的III期NSCLC患者进行标准放化疗后给予durvalumab（抗PD-L1）可显着延长总生存期。②伊匹木单抗（抗CTLA4）与姑息性放疗联合治疗难治性转移性NSCLC导致18％的患者出现客观反应，血清IFNβ的改变和T细胞克隆性的早期改变预示了反应。中度大分割放射治疗，如3x8Gy或5x6Gy，是根据临床前数据选择的，表明这些提供了最高程度的有利免疫调节。

2、未来研究DDR抑制剂和免疫的试验

根据之前提供的临床前数据，我们认为其他免疫调节，例如由DDR抑制剂辐射诱发的免疫调节，可能会进一步提高应答率。尽管放疗和ICI联合试验现在是一个非常活跃的领域，但放疗联合DDR抑制剂的临床试验很少见。在针对DNA损伤的cGAS监测微核研究发表改变了这种情况。虽然DNA-PK抑制与放疗和ICIs联合的临床前研究尚未进行，但联合抗PD-L1药物avelumab的临床试验已经开始招募。PARP抑制剂奥拉帕尼联合durvalumab的临床试验也在SCLC患者中招募。然而，DDR抑制剂的添加可能会进一步使临床症状的解释复杂化。

（1）放射疗法诱导的肿瘤细胞微核激活了胞质核酸传感通路，例如环GMP-AMP合酶（cGAS）-干扰素基因的刺激物（STING），并且所产生的炎症信号的传播重塑了肿瘤微环境的免疫环境。

（2）放疗后固有的肿瘤细胞信号事件对炎症性肿瘤微环境的重塑有深远的影响。（3）在理解潜在的生物学方面已经取得了巨大的进展，通过这种生物学，对受损宿主DNA的感知被转化为对肿瘤细胞的强化免疫监视。

谈一谈优点：

1.理解反应的可变性对于释放免疫系统的全部潜力以改善接受放射治疗的患者的预后至关重要。

2.挑战性的问题仍然围绕着增强放疗的免疫刺激作用而不引起免疫抑制的负面影响的最佳方法。

3.通过DDR抑制剂增强放射治疗的免疫原性效应，同时通过ICIs抑制免疫抑制作用是一种特别有前途的治疗方法。

4.内容很丰富，从机制上阐述了放疗后重塑肿瘤细胞炎症微环境，主要重点阐述细胞质核酸传感和DDR抑制剂。

5.系统总结临床前和临床放疗联合免疫的相关研究及进展。

6.结合现有研究及进展，指出其临床意义，并为未来研究指明方向。

7.临床前的研究非常多，最终是要回到这些基础上寻找突破口。

说一说不足：

1.文章重点讲述的是cGAS-STING和DDR抑制剂，其他免疫相关的机制未阐述。2.放疗分割剂量及放疗联合免疫治疗时机未阐述。

McLaughlinM,PatinEC,PedersenM,WilkinsA,DillonMT,MelcherAA,HarringtonKJ.Inflammatorymicroenvironmentremodellingbytumourcellsafterradiotherapy.NatRevCancer.Apr;20(4):-.doi:10./s---1.EpubMar11.PMID:.

“乘坐伽马射线漫游太空，突然想起月球旅行记，猎户座持续燃烧，量子玫瑰，无比绚烂。”

——roysterlee《春风沉醉的夜晚》

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