骨髓单个核细胞中B淋巴细胞诱导成熟蛋白

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中国实验血液学杂志

年第5期

骨髓单个核细胞中B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1表达对多发性骨髓瘤患者预后的影响

刘国生，王姣平，褚志华，余莹莹，周维*

（医院，湖北恩施）

目的：研究分析骨髓单个核细胞中B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1(Blymphocyteinducedmaturationprotein1,Blimp1)的表达对多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)预后的影响。方法选取本院年1月-年1月期间收治的48例MM患者，检测所有入组患者骨髓中Blimp1表达水平，依据Blimp1转录表达水平的中位值将入组患者分为低表达组(L组，22例)和高表达组(H组，26例)，比较分析Blimp1不同表达水平的相关影响因素，比较Blimp1不同表达水平患者的临床疗效、免疫表型变化及无进展生存期差异。结果2组患者在性别、年龄、分型、分期及治疗阶段等方面均无统计学差异(P0.05)。低表达组总缓解率明显高于高表达组，差异有统计学意义(P0.05)。治疗前两组患者CD19、CD38、CD56、CD及微小病灶残留阳性率均无统计学差异(P0.05)；治疗后低表达组患者CD38、CD56、CD及微小病灶残留阳性表达率均明显低于高表达组，CD19+表达率明显高于高表达组(P0.05)。低表达组1、2、3年无进展生存期(PFS)均明显高于高表达组(P0.05)。结论分期越高，治疗难度越大的MM，其患者Blimp1表达水平越高，低Blimp1表达水平的患者，其临床疗效及预后均明显优于高表达患者。

B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1；多发性骨髓瘤；骨髓单个核细

B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1(Blymphocyteinducedmaturationprotein1,Blimp1)在人类是由PRDM1基因所编码的蛋白。Turner等[1]于年在诱导小鼠B淋巴细胞株BCL1分化实验中发现，白介素2和白介素5可明显诱导与Prdml基因具有高度同源结构的Blimp1基因表达，在BCL1细胞分化为有分泌IgM功能的细胞过程中，可以看到Blimp1mRNA的水平上调，从而引起具有分泌功能的浆细胞分化，确立了Blimpl蛋白在浆细胞分化中的作用。而且，过表达Blimp1足以促使B细胞向浆细胞方向分化，接下来的一些报道进一步证实了这项结论的正确性[2]。Blimp1表达于所有浆细胞以及少量具有浆细胞特性的生发中心B细胞中[3]。多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞疾病，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，而浆细胞是B淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞。目前，WHO将其归为B细胞淋巴瘤的一种，称为浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤。Blimp1已被证实是生发中心B细胞向浆细胞分化过程中一个重要的转录抑制因子[4]。有研究报道，Blimp1基因的突变或者其它原因导致的Blimp1蛋白的减少或缺失在淋巴瘤，尤其是ABC-DLBCL的发病机制中起着关键作用[5]。而Blimp1与MM的相关性鲜有报道，本研究通过观察48例MM患者Blimp1水平，分析其与MM的相关关系。

1资料与方法病例资料

医院年1月-年1月期间的48例MM患者，严格筛选入组患者，入组患者均依据WHO诊断标准确诊为MM。所有入组患者均取得知情同意，经过本院伦理委员会批准通过。排除合并其他血液系统疾病、其他脏器肿瘤、合并其他脏器严重功能障碍患者，排除半年内应用化疗药物患者。最终入组患者共48例，其中男性27例，女性21例；平均年龄47.56±7.23(35-67)岁；IgG为主的患者23例，IgA为主的患者15例，轻链为主的及其他类型共10例；Durie和Salmon分期为I期患者21例，Ⅱ期18例，Ⅲ期9例；初发患者29例，复发或难治患者19例。检测所有入组患者骨髓中Blimp1表达水平，依据Blimp1转录表达水平的中位值将入组患者分为低表达组(L组，22例)和高表达组(H组，26例)，所有入组患者均采用硼替佐米+沙利度胺+地塞米松的治疗方案进行治疗(硼替佐米1.0-1.3mg/(m2·d)，d1、4、8和11；地塞米松30mg/d，d1-4；沙利度胺mg/晚，睡前服用，21d为1个疗程，4-6疗程)。

试剂及仪器

免疫表型检测三色免疫荧光标记，即采用流式细胞仪多参数直接免疫荧光技术，CD45/SSC设门,对入组患者骨髓标本标记CD10、CD13、CD19、CD20、CD34、CD38、CD45、CD56、CD、CD、Kappa和Lambda进行检测。CD%，CD%，其余30%为阳性标准。

诊断及评价标准

WHO诊断MM标准(年)主要标准[6]①骨髓浆细胞增多(30%)；②组织活检证实有浆细胞瘤；③M-成分：血清IgG35g/L或IgA20g/L，尿本周蛋白1g/24h。次要标准①骨髓浆细胞增多(10%-30%)；②M-成分存在但水平低于上述水平；③溶骨性病变；正常免疫球蛋白减少50%以上：IgG6g/L，IgA1g/L，IgM0.5g/L。

诊断MM要求①具有至少1项主要标准和1项次要标准；②或者具有至少3项次要标准而且其中必须包括其中的1项和2项。患者应有与诊断标准相关的疾病进展性症状。

国际MM工作组(IMWG)标准[7]OR(总有效率)=CR(完全缓解率)+VGPR(非常好的部分缓解率)+PR(部分缓解率)。无进展生存期(PFS)：初始治疗时间为观察起点，疾病出现进展表现或死亡事件为观察终点。随访截止时间为年5月。

检测方法

MM患者均于化疗前1d及规律化疗2-6个周期后的第1天，由临床医师采集骨髓液1ml，EDTA-K2抗凝，分离骨髓单个核细胞(BMMNC)，加1mlTRIzol试剂，吹打混匀以破碎细胞，-80℃保存。

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Blimp1的相对表达量测定(将24例相关疾病缺铁性贫血患者作为对照)用Ficoll分离液分离骨髓单个核细胞(BMMNC)，TRIzol试剂提取BMMNC中总RNA，NanoVueplus超微量分光光度仪检测RNA的浓度和纯度，取吸光度(A/nm)值在1.8-2.0之间样本用于后续试验。按照逆转录试剂盒说明合成第一链cDNA，置-20℃保存。根据GenBank中Blimp1和GAPDH基因的序列号(分别为、)，用PrimerPremier5.0软件设计引物，并送上海生工公司合成。Blimp1上游引物序列:5′-TCCAGCACTGTGAGGTTTCA-3′，下游引物序列：5′-TCAAACTCAGCCTCTGTCCA-3′，退火温度60℃，产物片段大小为bp;GAPDH上游引物序列:5′-AGAAGGCTGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，退火温度60℃，产物片段大小为bp。以GAPDH为内参基因。实时荧光定量PCR总体系为20μl，包括SYBRPremixTaqⅡ10μl，10μmol/L上、下游引物各1.0μl，cDNA模版2.0μl，ddH2O6.0μl。循环参数:95℃10min；然后95℃15s，60℃1min，共40个循环;在65℃-95℃时用SDSSoftware软件分析熔解曲线。用2-△△Ct法计算Blimp-1的相对表达量，其中△△Ct=(CtBlimp-1-CtGAPDH)MM-(CtBlimp-1-CtGAPDH)IDA。所有入组患者的△△Ct值由高到低依次为0.98、1.14、1.21、1.25、1.32、1.33、1.35、1.35、1.35、1.37、1.41、1.42、1.46、1.48、1.50、1.50、1.52、1.56、1.59、1.78、1.83、1.95、2.02、2.02、2.02、2.02、2.02、2.06、2.07、2.07、2.08、2.10、2.10、2.12、2.12、2.13、2.14、2.22、2.22、2.22、2.36、2.36、2.37、2.38、2.40、2.45、2.45、2.47。

统计学分析

采用SPSS17.0对获取数据进行统计学分析，计量资料采用表示，采用独立样本t检验进行组间比较，计数资料采用卡方检验进行组间比较，采用Logistic回归分析进行多因素分析，P0.05为差异有统计学意义。

2结果

一般资料比较

2组患者在性别、年龄、分型、分期及治疗阶段等方面均无统计学差异(P0.05)，但在分期方面高表达组高分期患者比率呈上升趋势，治疗阶段方面高表达组复发难治患者比率也呈上升趋势(表1)。

临床疗效比较

低表达组总缓解率明显高于高表达组，差异有统计学意义(P=0.)(表2)。

Table1.Basicinformationofpatientsinlowexpressiongroupandhighexpressiongroup(n)

Table2.Clinicalefficacyofpatientsintwogroups(n/%)

*P0.05,

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